核桃(Juglans regia L.)属胡桃科(Juglandaceae)胡(核)桃属(Juglans)，国外称为英国核桃、欧洲核桃或波斯核桃，是胡(核)桃属中栽培最为广泛的品种(吴国良等, 2009)。核桃是温带坚果树种，具有极高的经济价值。核桃果实富含蛋白质、脂肪、矿质元素和碳水化合物，其木材由于高密度特性可用于制作家具、枪托、橱柜和胶合板，其果皮可用于纺织染色(赵登超等, 2009; 董超萍等, 2011)。分子生物学技术特别是基因工程的发展促进了核桃中特异基因的开发，现已克隆出一些有价值的基因，如控制核桃早实性的早实基因，对其基因的控制表达进行研究有助于加深对植物童期的认识。离体繁殖技术是核桃优良品种培育所广泛使用的一门技术，可节省大量人力和物力，在过去的几十年里开展了以不同材料(顶芽, 茎段, 叶片, 叶柄, 子叶, 胚等)为外植体的微繁，并总结出一套行之有效的试验方案(Payghamzadeh and Kazemitabar, 2011)。转基因技术为培育核桃优良特性品种提供一种较为有效的手段，目前已经得到育种专家的极大关注。这些研究工作促进了核桃优良品种培育发展，为核桃标准化栽培提供基础条件。

1核桃基因的克隆研究
1.1苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因
苯丙氨酸解氨酶(PAL, E.C4.3.1.5)是催化苯丙烷代谢途径第一步反应的酶，也是这个途径的关键酶和限速酶。苯丙烷类途径生成的黄酮、类黄酮、木质素和生物碱等次生代谢在植物的生长发育过程中起着重要的作用，所以PAL对植物的生理意义非常重大。王燕等(2008)根据PAL基因设计兼并引物，克隆得到核桃苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因cDNA片段，并命名为JrPAL，Genbank登录号为AY747676。JrPAL长866 bp，编码289个氨基酸。通过核苷酸和蛋白质序列多重比较，发现JrPAL与其他植物的PAL基因高度同源。Claudot等(1993)研究表明，PAL活性与杂种核桃(Juglans nigra L.×Juglans regia L.)插条的生长率之间存在一定的比例关系。通过克隆JrPAL，研究人员获得了调控核桃黄酮化合物的代谢基因资源，在此基础上借助转基因技术研究其表达调控机理，从而揭示其在核桃插条生长过程中所起的作用。

1.2水通道蛋白(CcPIP)基因
植物CcPIP是调节水分在细胞间以及植物整个体内水平衡的分子基础，这类蛋白在植物的各种组织大量存在，通过与其他物质成分的集合形成特异的水分运输通道，有助于水分的长距离运输和细胞内外的跨膜水分运输。艾雪等(2009)以山核桃(Cara cathayensis Sarg.)为材料，利用cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE)技术克隆出山核桃水通道蛋白(CcPIP)的基因全长，并应用BLAST软件进行序列同源行分析，结果显示核桃CcPIP基因与多种水通道蛋白植物的氨基酸序列具有较高的同源性，其中与葡萄和菜豆的同源性最高为99%。这项研究结果从分子水平为研究山核桃嫁接成活过程中水分的运输提供理论支持，对于揭示CcPIP基因在山核桃接穗和砧木连接成活过程中的相关功能和水分运输途径提供物质基础。

1.3成花基因
He等(2011)利用RT-PCR和RACE技术从核桃早实品种“中林5号”花芽中克隆出LEY基因的同源基因JrLFY (Genbank登录号: GU194836)，cDNA序列大小为1 496 bp，其中开放阅读框(ORF)为1 158 bp。与其相应的基因组序列(Genbank登录号: HQ019159)显示，JrLFY包含3个外显子和2个内含子，推测编码385个氨基酸，并含有与其他LEY同系物相应序列的C末端保守区域。LEY系统进化树黄表明，核桃的LEY蛋白与山核桃、栗树相应蛋白相似。这项研究为了解核桃早实性机制提供了基础条件，为下一步将JrLFY基因导入晚实核桃做准备。黄有军等(2009)利用互补脱氧核苷酸扩增片段长度多态性(cDNA-AFLP)技术从山核桃中克隆成花相关的特异基因片段(TDFs)，经测序和序列同源性分析，其中65个TDFs为未知基因序列，213个TDFs具有同源序列，其功能涉及激素合成、酶合成、细胞信号转导、叶绿素合成和光诱导等。李敏(2009)以早实核桃花芽为材料，利用同源序列法克隆出jrAP1 (jrAPATALLA1)基因全序列和jrSEP1 (jrSEPALLATA1)、jrNEF1 (jrNO EXINE FORMATION 1)基因的部分片段，序列分析表明jrAP1与白桦、桉树的MADS-box基因具有较高的同源性(分别为76%, 62%)，归入MADS-box基因家族AP1亚家族；jrSEP1基因与板栗、大豆、桃树的MADS-box基因具有较高的同源性(分别为92%, 92%, 88%)，归入MADS-box基因家族SEP1亚家族；jrNEF1与调控葡萄、杨树、拟南芥花粉壁形成的基因具有较高的同源性(分别为88%, 83%, 89%)，是调控花粉壁形成的一类基因。Breton等(2004)利用体胚再生获得早实核桃苗，并从中克隆出调控花芽分化的基因AGAMOUS (AG)和APETALA3 (AP3)的同源基因，被命名为jrAG和jrAP3，分别属于MADS-box基因家族的AG亚家族和AP1亚家族。APETALA3 (AP3)和AGAMOUS (AG)都是决定花器官形成的基因。

1.4早实基因
在普通核桃中存在着一类播种1~2年后就能开花结实的早实类群。早实核桃的童期(幼年阶段)大大缩短，这一特性在核桃的栽培和育种实践中具有重要的意义。研究者利用分子生物学技术寻找与核桃早实性状相关的基因研究。奚声珂(1987)通过对我国核桃属的优良品种早实核桃的杂交试验研究，初步认定核桃的早实性状是由两对以上的等位基因决定的显性性状。杨克强等(2002)利用RAPD分子标记技术获得与核桃早实基因连锁的特异标记OPB-08₉₀₀，完成了对早实基因的定位，为下一步早实基因的克隆奠定了基础。王国安等(2004)以早实核桃和晚实核桃类群为试材，参照分群法(Bulked Segregant Analysis, BSA)，运用RAPD技术初步确定OPG15₇₁₀是与核桃早实基因相关的RAPD标记。张虎平等(2007)利用构建的早实核桃和晚实核桃近等位基因池DNA，获得与核桃早实性相关的显性的RAPD标记OPG15₇₅₉，并将其转化为稳定的SCAR标记。牛建新等(2008)利用引物OPG15 (5'-ACTGGGACTC-3')扩增得到一条约710 bp的早实核桃特异片段。朱天丁等(2011)采用RACE技术克隆了SCAR标记的核桃早实性相关基因片段的末端序列，为验证其功能和早实核桃分子育种奠定基础。

1.5其他基因
核桃的壳厚薄影响出仁率和取食的难易，是核桃品质好坏的重要指标。张丽(2008)利用RAPD技术，并参照BSA法，寻找到与核桃壳厚薄基因相关的分子标记SBS-T16₁₂₂₄，并将其转化为SCAR标记。Goué等(2003)利用同源序列法从黑核桃(Julgans nigra L.)和普通核桃(Julgans regia L.)的杂种核桃中克隆出周期蛋白依赖激酶A (CDKA)基因。研究发现CDKA基因在核桃的纵向生长过程中表达，通过对CDKA基因的内含子的大小和位置以及Southern杂交显示，在杂种核桃的基因组中存在CDKA基因的多个拷贝(大于2)。CDKA在协调叶片细胞分裂和分化，促进叶片发育过程中起着关键的作用。Teuber等(1999)从核桃中克隆出种子储存前体蛋白Jug r 2的cDNA序列，核桃蛋白Jug r 2与豌豆球蛋白类似，是一种主要的食物过敏蛋白。
 
2核桃基因的导入研究
2.1筛选标记基因
标记基因被用于从大量的非转化细胞中筛选出正确的转化子，可以为获得真正的转化体提供可靠的依据，在核桃遗传转化的过程中发挥着至关重要的作用，有效的筛选可以提高转化效率。McGranahan等(1988)利用农杆菌转化法首次将外源基因Kan (抗卡那霉素基因)基因成功导入核桃体细胞胚中，但转化效率很低，且技术手段复杂。Dandekar等(1989)利用改进后的方法将GUS (β-葡萄糖醛酸酶)基因和APH (3') (氨基糖苷磷酸转移酶)基因转入核桃体胚中，提高了转化效率。通过试验测定发现，Kan不会杀死体胚组织，但抑制了未转化次生胚的形成。El Euch等(1998)将nptⅡ(新霉素磷酸转移酶Ⅱ)基因和GUS基因导入杂种核桃(Juglans nigra L.×Juglans regia L.)体细胞胚中。Escobar等(2000)将GFP (绿色荧光蛋白)基因成功导入核桃体胚中，试验测定认为，使用GFP作为筛选基因可以明显减少遗传转化过程中的工作量和工作时间，降低成本。

2.2有价值基因
Dandekar等(1994)将编码杀虫晶体蛋白或δ-内毒素(即Bt蛋白)基因之一的cryⅠA(c) (原毒素)导入核桃体细胞胚中，但转基因植株抗虫能力较差，这是因为该基因的遗传密码发生较大偏移，其来源于苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的野生变种(B. thuringiensis var. kurstaki) cryⅠA(c)基因序列。然而，Dandekar等(1998)将人工合成的完整cryⅠA(c)基因再次转入核桃体胚中，再生植株表现出较高的抗虫性，同时也证实了在核桃受到昆虫伤害时，这种途径对于昆虫防御反应的有效性。

汤浩茹等(2001)哈兹木霉几丁质酶ThEn-42基因导入核桃体细胞中，检测转化的体细胞系的的几丁质酶的活性提高了几十到几千倍，哈兹木霉几丁质酶ThEn-42基因在核桃中得到表达。几丁质酶是一种诱导酶，是植物受到病原菌侵染后产生的防御物质之一，可以催化几丁质(真菌细胞壁的主要成分)水解，以及分别肽聚糖(细菌细胞壁和节肢动物外骨骼的主要成分)。Escobar等(2002)将色氨酸单加氧酶(iaaM)基因和异戊烯转移酶(ipt)基因转移到核桃中，通过诱导沉默了植株体内这两个基因的表达，从功能上提高了植株对冠瘿病的抗性。

核桃新梢难以生根，主要是大量的类黄酮酚类化合物存在于核桃插条内，这类物质大量在新梢的周围组织的积累直接阻碍根的诱导。查尔酮合成酶(CHS)基因控制类黄酮酚类物质的合成，CHS是植物花色素苷等类黄酮化合物生物合成途径中的一个关键酶，它催化丙二酰辅酶A (malony CoA)的三个乙酸基与对羟基苯丙烯辅酶A (coumaryc CoA)的一个乙酸基的缩合，生成基本结构为一个三碳环连接两个芳香烃的四羟基查尔酮(naringenine chaalone)，再经过异构化能导致花色素苷、黄酮、异黄酮等类黄酮物质的合成。El Euch等(1998)和Jay-Allemand等(1991)将CHS反义基因导入到杂种核桃(Juglans nigra L.×Juglans regia L.)体细胞胚中，经检测再生植株中CHS活性极低，同时栎苷、杨梅苷、儿茶素、花色素苷等黄酮类物质未检测到，外源生长素加强了转基因植株在诱导生根阶段的敏感性，提高了生根能力。Vahdati等(2002)将rolABC基因转入奇异核桃("Paradox") (Juglans hindsii L.×Juglans regia L.)的体细胞胚中，对比转化系与为转化系的各项表型特征(包括生根潜力)，以普通核桃为砧木嫁接获得转化系和未转化系，剪取插条经K-IBA处理，观察发现二者生长高度相同，但冠层明显不同，转化系上层生长浓密且叶片稍微卷曲，枝条节间长度变短，节点和侧枝数目增加，春季枝条伸长和秋季进入落叶期推迟；另一组试验中，以"Chandler"为接穗嫁接到转化系和未转化系的砧木上，二者对接穗均无明显影响，但二者根的形态特征明显不同，存在转化系砧木直径超过15 cm的须根数量相对较少，进一步测定发现，转化系根数量明显多于未转化系，但干重低于未转化系，这说明转化系作为砧木促进生根，但对接穗的表型无明显影响。
 
3核桃遗传再生体系的建立
植株再生体系的建立是进行基因遗传转化的前提和基础。目前植物界常用的转基因再生的组培系统为：(1)原生质体再生，用于直接DNA转化和农杆菌介导转化；(2)叶、茎外植体再生，只适合于农杆菌介导转化。但是，迄今为止，还没有原生质体再生培养的成功报道，而叶圆片再生已经有成功案例(表1)。刘淑兰和韩碧文以叶片、茎尖和叶柄为外植体(刘淑兰和韩碧文, 1984, 植物生理学通讯, 4: 38)，诱导愈伤组织的形成，诱导培养基为WPM+10 mg/L BA+4 mg/L NAA+2 mg/L ，但没有获得完整植株。Roschke和Pijut首次以黑核桃叶片为外植体(Roschke C., and Pijut P.M., 2006, http://www.agriculture.purdue.edu/fnr/htirc/pdf/posters/Christian.pdf)，利用筛选出最佳诱导培养基1/2DKW+1/2WPM+0.2 mg/L IBA+1.5 mg/L TDZ，暗培养3周后转接，分化培养基1/2DKW+1/2WPM+2.0 mg/L BA+0.001 mg/L IBA+0.000 5 mg/L BS，光照下培养5周后，成功实现植株再生。邢瑞丹等(2010)以“香玲”核桃叶片外植体，筛选离体叶片的最适分化和生根培养基，分别为MS+0.5 mg/L BA+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L TDZ，1/2DKW +5.0 mg/L IBA，同时优化离体再生条件。
 

表1 核桃叶片愈伤报道一览表 Table 1 The list of published reports that achieved callogenesis from the walnut leaves (Jugans spp.)

核桃的体胚由于具有完整的两极结构，次生胚能反复再生形成胚无性系，这种体胚发生是核桃转基因研究良好的离体培养再生系统(表2)。Tulecke和McGranahan (1985)首次以函兹核桃(Juglans hindsii)的未成熟子叶为外植体进行次生胚的增殖，实现了体胚的再生。Yates (1990)通过研究不同的激素水平下不同核桃品种的体胚再生，发现不同的品种间胚性细胞的感知能力存在差异性。Rodriguez和Wetzstein (1994)的研究表明，不同类型和浓度的生长素对体胚的形态及转化为植株的比例存在差异，在促进愈伤组织的增殖方面萘乙酸不如2,4-D，但其有利于类似合子胚结构的形成和球状胚向植株的转化，而2,4-D在体胚的增殖方面效果较好。Dumanoglu (2000)发现干燥和GA₃处理提高核桃体胚的萌发率，且二者的组合强于单独处理，干燥下暗培养15后萌发率最高(46%)。Vahdati等(2008)研究认为ABA (脱落酸)促进了体胚成熟和萌发，但阻碍了次生胚的再生，而蔗糖提高了次生胚的数量，但对胚的成熟没有任何影响。Sirmandi等(2010)优化了核桃体胚再生体系，发现Gelrite在促进体胚的再生方面优于聚乙二醇(PEG)，当其浓度为0.2%时次生胚再生率最高(70%)，但随着Gelrite的浓度提高，正常胚数量下降。进一步的研究发现，对体胚进行冷冻预处理(4℃下保持4周)后，在添加植物生长调节剂和0.3%的Gelrite的培养基上，体胚转化为植株的比例最高(50%)。Ali等(2010)研究结果也证实了上述结论，同时发现7.5% PEG是产生子叶胚的最佳浓度，3.0% PEG是产生正常胚(白色不透明状，有两片子叶，根、茎分生组织可见)的最佳浓度，0.5% Gelrite和7.5% PEG导致最大畸形胚的产生，冷冻处理转化为植株的比例最低，但促进根的萌发，添加植株生长调节剂促进萌发的效果不如冷冻处理，仅仅促进新梢的萌发。
 

表2 核桃体胚发生报道一览表 Table 2 The list of the published reports that achieved somatic embyrogenesis in walnut (Jugans spp.)

Merkle和Wetzstein (1987)首次诱导出美国山核桃的的体胚再生。随后，Wetzstein等(1989)进一步的研究发现，授粉15周时山核桃体胚的再生率最高，MS培养基优于WPM培养基，低浓度的NAA诱导效果好于2,4-D，同时进行5周的低温和干燥处理可以加强了胚转化为植株的能力。Burns和Wetzstein (1997)以未成熟子叶为材料研究山核桃体胚的悬浮培养，在添加NAA的固体培养基上进行诱导体胚产生，转移到无植物生长调节剂的液体培养基上增殖培养，此时的悬浮液由球状胚聚合体、悬浮球状胚和球状胚前体聚合体组成，然后用滤纸收集球状胚前体转移到固体培养基进行球状胚生长，进而转变成植株，这是胡桃属胚发生培养取得的重要进展。张启香等(2011)以山核桃自然授粉后10周的幼胚为材料，对影响胚性愈伤组织和体胚发生的主导因子（基本培养基、植物生长调节剂等）进行了比较分析，幼胚胚轴和子叶在1/2MS培养基上胚性愈伤组织的诱导率显著高于其他处理，幼胚在DW (DKW所有元素半量加WPM所有元素半量)培养基上的体胚的诱导率显著高于其他处理。
 
4核桃遗传转化方法的研究
目前已经报道的较为成熟的植物遗传转化的方法主要分为两大类：一类是以外源生物为载体介导的转化方法，主要有农杆菌介导法和病毒介导法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，在双子叶植物的遗传转化领域应用广泛；另一类是基因直接转移技术，主要是通过人工的方法(物理或化学法)将目的基因导入植物细胞，包括基因枪法、花粉管通道法、原生质体法、PEG介导转化法、电击转化法等(马明, 2007)。

McGranahan等(1988)用核桃体胚为受体进行遗传转化的研究，建立了胚胎发生-农杆菌介导系统，首次获得抗卡那霉素的转基因完整植株。这个系统的特点为：(1)适于多种树种；(2)具有抑制嵌合转基因植株形成的潜力，可以将有价值基因插入商业用品种中而不失基因的完整性(朱丽华, 1993)。这种遗传转化方法是目前应用最为广泛的外源基因的导入途径，但是这种方法不可避免的导致畸形胚的出现，体胚的增殖受到严格的条件限制，这些都不利于植株的再生。相比较器官再生途径，这些都是体胚作为受体进行遗传转化的限制因素，随着叶片愈伤再生体系的建立，核桃器官发生途径将会受到越来越多的关注。

侯立群等利用花粉管通道法和微注射法将外源基因导入到核桃未成熟的幼胚和子房中(侯立群等, 2004, 山东林业科技, 1: 8-9)，发现不同的处理手段对坐果率影响不同，同时需要进一步对基因的整合进行鉴定。王晓蔓(2009)通过对核桃花粉管通道法中外源DNA浓度、导入时间、和导入方法等因素的研究，发现外源DNA浓度为200 μg/mL和500 μg/mL时，结实率和果实子叶GUS基因的瞬时表达率最高，授粉14~48 h后是最佳的导入时间，切割柱头滴加法是最适宜的导入方法，这种方法既能保证坐果率，又有利于外源DNA的导入。值得注意的是，这种遗传转化的方法会受到季节性环境条件的严格限制，大大减少应用的潜力。

5问题和展望
核桃的的早实特性引起了育种专家的极大关注和深入研究，利用这一特性可以通过人工手段缩短果树的童期。早实基因作为十分珍贵的自然资源，通过克隆核桃的早实基因，并利用转基因技术研究其表达机理和进行性状鉴定，可应用于核桃育种和栽培实践，从而有助于我们进一步揭示木本植物童期发育的机理。目前，只获得一些与早实性状相关的分子标记和特异基因片段，还未获得其完整基因序列，未来应充分利用现有的自然资源克隆早实基因，并通过转基因技术进行基因的导入，通过基因序列的对比和性状的观察验证基因的表达。

虽然在核桃体胚再生方面的进行了广泛深入的研究，但是体胚的成熟、萌发以及转化成植株的比例依然很低，这是制约核桃体胚再生发展的主要因素。除此之外，不同的核桃品种在体胚的再生培养方面存在差异，每一个品种都需要尝试和探索，以获得最佳的培养条件和激素配比。对于体胚的起源，需要进行细胞学观察和基因型测序，以获得准确而可靠的结果。Polito等(1989)的研究表明，体胚来源于子叶和初生胚的下胚轴，贯穿于表面细胞的的斜面。尽管对核桃初生胚的起源有多种观点，但其次生胚却是起源于表皮单细胞。尽管如此，仍然需要对体胚再生的植株进行鉴定，以确保材料准确。目前看来，叶圆片再生的遗传转化方法是进行外源基因导入的很有前途的手段，随着叶片再生体系的建立和优化，在核桃的转基因方面会得到应用。

到目前为止，核桃的转基因研究主要集中在抗病虫、提高生根能力等方面，并取得一定的成果。基因工程技术在核桃优良品种的遗传改良应用已经成为一种重要的手段，也越来越得到育种专家的青睐。但转基因核桃植株的后期观察和功能验证仍然是研究人员需要面临的问题，如何确保基因在后代的稳定遗传，遗传力的多少以及它的环境适应性问题都需要解决。随着我国核桃种植面积的广大以及病虫害的扩张，核桃的某些病虫害(如举肢蛾、细菌性黑斑病)已经严重威胁到核桃生产，培育抗病虫品种就显得很有必要，这也是根治核桃病虫害的根本途径。

作者贡献
李好先是本综述的主要执行人；郭俊英、薛华柏、刘丽负责本综述的后期修改；曹尚银是本综述的构思者。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由科技部科技基础性工作专项(2012FY110100)资助。感谢两位匿名的同行评审人的评议和修改建议。

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